血运重建联合曲美他嗪预处理骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

【摘要】目的：利用曲美他嗪（TMZ）预处理骨髓间充质干细胞（BMSCs），于心肌梗死急性期行血运重建联合细胞移植治疗，研究其对心功能改善的影响，并初步探寻其作用的机制。方法：体外部分：取6-8周龄SD大鼠的胫骨及股骨分离骨髓间充质干细胞，用全骨髓差异贴壁法培养及纯化BMSCs，并取第3代BMSCs用于本实验。利用1-3天的SD乳鼠心脏在体外分离培养新生大鼠心室肌细胞（NRVMs），取原代培养第3天的心肌细胞，分别收集正常和缺氧/复氧（H/R）处理的心肌细胞上清液，对其上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量进行检测。将P3代BMSCs分为以下四组：①Control组：BMSCs+正常细胞培养液；②H/R组：BMSCs+H/R上清液；③TMZ组：TMZ预处理BMSCs+正常细胞培养液；④TMZ+H/R组：TMZ预处理BMSCs+H/R上清液。利用CCK-8法检测上述各组BMSCs的细胞活性，RT-PCR检测其细胞Bcl-2、Bax的表达。体内部分：细胞移植前用荧光染料CM-Dil标记BMSCs，建立大鼠心肌缺血再灌注(I/R)模型32只，随机分为四组：①Sham组：冠脉只穿线不结扎；②I/R组：结扎冠状动脉1h后开放阻断的冠脉（模拟血运重建），注射无细胞的上清液；③BMSCs组：结扎冠状动脉1h后开放阻断的冠脉，注射无药物预处理干细胞；④BMSCs+TMZ组：结扎冠状动脉1h后开放阻断的冠脉，注射药物预处理干细胞。各组于I/R后3h采集大鼠血清进行LDH、MDA及SOD的测定。术后1周各组随机处死2只大鼠，检测其植入体内的BMSCs的存活数量，其余大鼠饲养至移植后4周接受心功能测定，检查后处死，其中每组3只用于计算梗死面积，其余3只取心脏组织用于蛋白提取，WesternBlot分析Bcl-2及Bax的表达。结果：体外部分：1.与正常对照组比较，经过H/R处理过的心肌细胞上清液中LDH、MDA活性显著升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）。2.在BMSCs与心肌细胞上清液共培养各组中，H/R组细胞活力较Control组显著下降（P<0.05），但培养前经过TMZ预处理后，该组细胞的活力较H/R组可显著提高（P<0.05）。3.RT-PCR结果表明：H/R组细胞Bcl-2的基因表达水平稍有减少，但与正常组相比无差异（P＞0.05），但TMZ+H/R组细胞Bcl-2的基因表达水平较H/R组相比，前者明显高于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）；H/R组细胞Bax的基因表达水平稍有增多，可与正常组相比无差异（P＞0.05），但TMZ+H/R组细胞Bax的基因表达水平较H/R组相比，前者明显低于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）。体内部分：1.用“二线二结”法能够方便、成功地建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型。2.与Sham组比较，再灌注后3h其余各组LDH、MDA活性均显著升高（P<0.05），SOD活性均显著降低（P<0.05），三组组间两两比较无明显差异（P>0.05）。3.术后1周，将组织进行快速冰冻切片，在荧光显微镜下计数双标记BMSCs，发现BMSCs+TMZ组每个高倍镜下双标记细胞数显著高于BMSCs组（P＜0.05）。4.术后4周，BMSCs组和BMSCs+TMZ组均较I/R组心功能得到改善（P<0.05），但BMSCs+TMZ组相比BMSCs组心功能改善的更加明显（P<0.05）。5.与I/R组相比，BMSCs组和BMSCs+TMZ组均能减少梗死面积（P<0.05），但BMSCs+TMZ组较BMSCs组的梗死面积要减少的更多（P<0.05）。6.BMSCs+TMZ组Bcl-2蛋白表达水平明显高于I/R和BMSCs组（P<0.05），BMSCs+TMZ组Bax蛋白表达水平明显低于I/R和BMSCs组（P<0.05）。结论：1、体外心肌细胞H/R与大鼠心肌I/R均可使LDH、MDA显著升高，SOD显著降低（成功模拟缺血再灌注微环境）。2、缺血再灌注微环境中存在的严重细胞毒性和氧化应激不利于移植细胞存活。3、TMZ预处理BMSCs在缺血再灌注微环境中相比未预处理细胞其活性显著增加，其机制可能与预处理细胞上调Bcl-2及下调Bax的表达有关。4、血运重建联合TMZ预处理BMSCs后移植，相比未预处理移植细胞组，进一步减少了心肌梗死面积，心功能改善更明显。
【作者】胡小武；
【导师】惠杰；
【作者基本信息】苏州大学，心血管病学，2014，硕士
【关键词】骨髓间充质干细胞；急性心肌梗死；血运重建；曲美他嗪预处理；

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